Southern Blot DNA印跡雜交實驗全流程

Southern Blot DNA印跡雜交 實驗全流程

一、DNA 的提取人和哺乳動物細胞基因組DNA的分離通常是在有EDTA、Sarkosye等一類去污劑存在下，用蛋白酶K消化細胞，隨后用酚、氯仿抽提，經RNase 處理和純化來提取DNA。
(1)取單層細胞，經無鈣、鎂PBS洗一次，用0.25%胰蛋白酶消化，細胞懸液經PBS洗2次,棄上清，取細胞沉淀。
(2)加入2ml細胞裂解液(10mM Tris HCL，pH8.0，0.1mol/L EDTA，10mmol/L NaCL，1%SDS)充分混勻，加入蛋白酶K 至終濃度為0.5～1g/L、Sarkosye終濃度為0.5%，混勻裂解蛋白呈糊狀。
(3)50℃水浴2h，轉入37℃水浴過夜，次日加入等體積飽和酚，輕輕顛倒混勻，以防止DNA斷裂，約3min。 

12000r/min 離心15分鐘（室溫）
(4)取水相，再加入等體積酚/氯仿(1:1),同樣顛倒混勻，去除蛋白質12000 r/min 離心15分鐘（室溫）
(5)再重復步驟(4)，再用等體積酚/氯仿(1:1)抽提一次
(6)取水相，再加入等體積氯仿，去除酚及蛋白質，顛倒混勻
12000 r/min 離心15分鐘（室溫）
(7)取水相，加入2倍體積的預冷無水乙醇，沉淀DNA，混勻-20℃放置1小時
12000 r/min 離心15分鐘（室溫）
(8)用70%乙醇洗滌一次，按上法離心將沉淀真空干燥10分鐘。
(9)加入RNase A至終濃度100mg/L，37℃水浴消化1小時，消化污染的RNA。
(10)加入蛋白酶K 至終濃度0.4g/L、Sarkosye至終濃度0.5%，混勻，50℃水浴2小時，加入NaAC至終濃度10mmol/L。
(11)用等體積飽和酚各抽提一次，步驟同前。
(12)吸上清，加入氯仿/異戊醇(24:1)，按上法再抽一次。
(13)取水相，加入2倍體積預冷無水乙醇，-20℃ 1小時。
(14)取沉淀用70%乙醇洗一次，真空干燥10分鐘后溶于少量TE中，4℃貯存。

Southern對DNA的質量要求比較高，一般來說，高質量DNA 樣品需具備以下幾點：
① DNA 完整性好；
② DNA 純度高；
③ 勿用TE 溶解DNA；
④ DNA 濃度不低于0.7ug/ul，雜交需模板DNA 約20ug/泳道/次
二、引物設計三、DNA 檢測 

1、DNA濃度的測定
DNA濃度用紫外分光光度計測定，核酸的光吸收值位于波長260nm處，蛋白質則位于280nm，分別測定后，其OD260/OD280的比值應大于 1.8.低于此值，說明DNA中仍殘留較多的蛋白質，此時可用酚、氯仿繼續抽提純化。若比值大于1.9表明DNA鏈破壞，斷裂嚴重，已成為小分子，因此操作應輕柔。
取少許DNA溶液，經紫外線掃描，吸收峰值位于波長260nm處，其純度應為OD260/OD280=1.8,
OD260值為1的溶液大約含50μg/mL DNA，故DNA的濃度 (μg/mL)=OD260值×50μg/mL×稀釋倍數。DNA總量(μg)=DNA濃度(μg/mL)×總體積 (mL)
2、DNA分子量的測定
DNA分子量大小測定，可用含溴化乙錠的1%瓊脂凝膠電泳法測定，根據加入標準品片斷的電泳遷移距離計算樣品片斷分子量大小，此技術還可用作分離基因組 DNA，進一步進行Southern吸印分析。
四、探針制備（以PCR 標記方法為例）1、標記原理
Dig-dUTP 在Taq DNA 聚合酶的作用下，經基因特異的引物PCR 指數擴增，可摻入到新合成的DNA 分子中，從而完成DNA 探針的標記。在延伸反應中，每20~25 個核苷可有一個Dig-dUTP 分子摻入到新合成的DNA 鏈中。
2、操作步驟1）探針標記注意：在探針標記前，必須用普通PCR 優化反應條件（試劑盒中提供了過量的Taq DNA 聚合酶及其Buffer，建議用于條件優化），包括引物、退火溫度、延伸時間、模板量等，設定好最佳反應條件。任何非特異擴增可能導致高的雜交背景甚至假陽性。
在標記反應的同時，用普通dNTP 做一個相同體系的非標記PCR 擴增。擴增體系： 

PCR擴增：
95℃ 5min;[ 95℃ 30sec,60℃ 35sec, 72℃ 30sec;] 72℃ 5min;
30 cycles

2）標記探針檢測
取標記產物和普通PCR擴增產物各1μl，1.0%的瓊脂糖凝膠電泳。由于大分子量的DIG摻入，標記產物泳動速度比普通PCR產物要慢。所以根據電泳圖就可以判斷是否標記上和有沒有非特異標記！其余標記產物-20℃保存。 

如果要準確檢測標記效率（一般不必），取標記產物1μl和Dig標記的對照DNA，用DNA稀釋液按 10倍系列稀釋后點樣于帶正電荷尼龍膜上。用紫外交聯儀或真空烘烤固定DNA探針，按雜交檢測方法進行信號檢測，然后與膜條上的Dig標記的對照DNA信號強度對比，推算出標記的探針濃度。如初始模板量較大，可取1μl標記產物稀釋10~100倍后定量。
五、基因組DNA 酶切限制性內切酶(RE)可裂解雙鏈DNA，每種酶的特點是具有高度特異性的DNA裂解點和不同電離子強度的特殊反應條件。不同產品其反應條件不同，應根據說明書操作。單位(U)RE活性是在37℃ 1小時內能將1μg DNA所有特異性位點切斷的酶用量。若用兩種以上不同的內切酶，要注意RE的最適鹽濃度，要由低向高逐級添加適量鹽逐個進行DNA切割。
通常，10個單位的內切酶可以切割1μg不同來源和純度的DNA。
在正式酶切之前先用20μl小體系預酶切看是否切得動，然后用大體系37℃酶切過夜。
1、酶切體系：

每一種酶都有其相應的最佳緩沖液，以保證最佳酶活性，使用時的緩沖液濃度應為1×。有的酶要求100μg/ml的BSA以實現最佳活性。不需要BSA的酶如果加了BSA也不會受太大影響。
酶切完后，取5μl 酶切DNA樣品于1%的瓊脂糖凝膠上檢測酶切是否充分。如果酶切充分，灌制1%的agrose膠，加入上樣buffer后，在25-30V穩壓電泳 12-24hrs（包括DNA Marker）。
2、電泳
1%濃度瓊脂糖凝膠、TBE buffer（EB 染料電泳后染）
100ml TBE buffer中加入10μl 10mg/ml溴化乙錠（EB）,將凝膠放置其中染色30分鐘, 照相。
六、轉膜1、將膠裁成9.8cm×8.0cm 大小，于平皿中用蒸餾水沖洗一次；（此步一定記好膠的大小，后面裁紙/膜以及雜交液體積的選擇都要用到）
2、加入100ml 0.25 mol/L 的鹽酸脫嘌呤，室溫振蕩15~30 min，至溴酚藍完全變成黃色。（如果限制性片段＞10kb，酸處理時間可適當延長；若限制性片段很小，此步可省略）
3、用蒸餾水沖洗2 次。加入變性液（1.5mol/L NaCl、0.5mol/L NaOH）室溫振蕩20~30min；至溴酚藍完全恢復到原來的藍色。
4、用蒸餾水沖洗2 次。加入中和液（1.5mol/L NaCl、1.0mol/L Tris-Cl ， pH7.4）室溫振蕩2×15min；
5、用蒸餾水沖洗2 次。加入2×SSC 平衡凝膠和尼龍膜 5min；
6、虹吸印記法轉膜26 小時
1) 在方盤上放置一平板，其上放置一濾紙，濾紙兩端搭入盤內浸入2×SSC中，用玻璃棒趕走濾紙和平板之間的氣泡。
2) 將凝膠倒置于平臺上, 正面朝下，切掉右下角，并用保鮮膜封閉四周以防止吸水紙接觸凝膠的邊緣從而接觸平板造成液流的短路。
3) 將尼龍膜放于膠上，趕走氣泡。
4) 膜上放兩張濾紙，其上再放20層吸水紙。
5) 吸水紙上放一平板，其上放500g左右的重物，目的是建立液體從液池經凝膠向尼龍膜的上行通路，以洗脫凝膠中的DNA 并使其聚集到尼龍膜上。
6) 室溫下過夜轉膜，持續16小時以上，期間換紙2-3次。
7）完成轉膜后，膠染色，觀察轉膜效果。并標記好序號、加樣孔位置和對應分子量標準的位置，尼龍膜和凝膠直接接觸的一面為正面。
8）用2×SSC漂洗尼龍膜一次，濾紙吸干，紫外交聯儀下照射固定DNA(5000μJ /cm2)5min。
七、雜交1）預雜交：取8.0ml 65℃預熱的Hyb 高效雜交液（Hyb-100），加入雜交管中，排盡氣泡，65℃雜交爐中預雜交2h（8-15轉/分）。（此步中高效雜交液的用量根據 9.8cm×8.0cm計算所得，1ml高效雜交液/10cm²膠，9.8×8.0=78.4 ）
2）探針變性：將已標記好的探針沸水浴中變性10 分鐘，立即放冰水浴冷卻10min(探針一經變性，立即使用)，。

3）雜交：排盡預雜交液，在8.0ml 新Hyb 高效雜交液（Hyb-100）加入4.0μl 新變性好的探針(1-3ul/膜，5-20ng/ml雜交液)，混勻。65℃雜交儀中雜交過夜（8-15轉/分）。 

4）雜交完成后，將雜交液回收置于一可耐低溫又可耐沸水浴的管中，貯存于-70℃以備重復使用。重復使用時，解凍并在65℃下變性10min.。

八、洗膜、信號檢測（化學顯色法）1）雜交后室溫下，20 ml 2×SSC/0.1%SDS 洗膜2×5min。
2）50℃，20 ml 0.1×SSC/0.1%SDS 洗滌2×15min。（洗液需要先預熱到50℃）
3）再將膜置于20ml 洗滌緩沖液中平衡2-5min。
4）將膜在10 ml 阻斷液中阻斷30min（在搖床上輕輕搖動）。
5）封閉完成后倒出阻斷液，加入稀釋好的10ml 抗體溶液，浸膜至少30min。(Anti-Dig-AP 在10000rpm 離心5min。離心后將Anti-Dig-AP 用阻斷液稀釋(1:5000)，2.0μl Anti-Dig-AP 加入10ml 封閉液混勻)
6）去除抗體溶液，用20 ml 洗滌緩沖液緩慢洗膜2 次，每次15min。
7）去除洗滌緩沖液，在20 ml 檢測液中平衡膜2 次，每次2min。
8）用檢測緩沖液稀釋300μl NBT/BCIP 化學顯色底物，在約15ml 新鮮制備的顯色液中反應顯色，在顯色過程中勿搖動。

注意：在幾分鐘內即有顏色開始沉淀，并在16h后完成反應。為檢測顯色程度，膜可以短時堿暴露于光線下。9）當達到所需的點或帶強度后，用50ml雙蒸水或TE 緩沖液洗滌5 min 終止反應，照相記錄結果。

若是雜交結果不滿意，尼龍膜可經過處理進行重雜交。膜重雜交前的處理如下：

a. NBT/BCIP化學顯色法

1. 燒杯中盛裝適量的DMF(Dimethylformamid,二甲基甲酰胺)，通風櫥內50-60℃水浴。

注：DMF是揮發性的，且大約67℃時能夠燃燒。

2. 將膜置于燒杯內，溫育至褪色。

3. 用雙蒸水徹底淋洗膜。

4. 用20-30ml 0.2N NaOH，0.1%SDS(w/v)37℃震蕩洗滌2×20min。

5. 2×SSC平衡數分鐘。

6. 空氣干燥或立即用于雜交。

b. CDP-Star化學發光法

膜的存放

a. 若欲再雜交

在塑料袋中密封保存，任何時候膜都不能干。注：欲保持顏色，可用TE緩沖液保存。

b. 不再雜交

15-25℃干膜，存放。注：干膜過程中顏色會減淡，為再生顏色，可在TE緩沖液中濕潤。

Southern溶液的配制1、洗液Ⅰ的配制：250ml (2×SSC，0.1%SDS)
20×SSC 25ml 10%SDS 2.5ml ddH2O 至250ml
2、洗液Ⅱ的配制：100ml (0.1×SSC，0.1%SDS)
20×SSC 0.5ml 10%SDS 1ml ddH2O 至100ml
3、洗滌液：250ml (馬來酸緩沖液：Tween-20=1：0.3%)
馬來酸緩沖液 250ml Tween-20 750ul 

4、馬來酸緩沖液：(1×) 1L
馬來酸 11.607g NaOH 7.88g NaCl 8.77g
定容至1L，用固體調至PH7.5，高壓滅菌。
5、阻斷液(10×) 500ml
Blocking Solution 50g 馬來酸緩沖液 定容至500ml
70℃水浴溶化混勻，然后121℃高壓滅菌(高壓時蓋子要松)

6、20×SSC 1L
在800ml水中溶解，NaCl 175.3g 檸檬酸鈉 88.2g

10mol/L NaOH調節pH值至7.0.加水定容至1L，分裝后高壓滅菌
7、10%SDS 1L
在900ml水中溶解100g電泳級SDS，加熱至68℃助溶，加入幾滴濃HCl調節pH值至7.2，加水定容至1L，分裝備用。 

注意：SDS的微細晶粒易擴散，因此稱量時要戴面罩，稱量完畢后要清除殘留在稱量工作區和天平的SDS，10%SDS溶液無須滅菌，過濾。8、TE pH 8.0 1L
10mmol/L Tris?HCl(pH 8.0) 1 mmol/LEDTA(pH 8.0)
9、檢測緩沖液(5×) 1L
0.5mTris?HCl 60.57g 0.5m NaCl 29.25g 調pH值至9.5
10、PBS緩沖液
NaCl 8g KCl 0.2g Na2HPO4 1.44g KH2PO4 0.24g
濃HCl調pH至7.4
11、變性緩沖液 1L
1.5M NaCl 87.66g 0.5M NaOH 20g
12、0.25M HCl(脫嘌呤液) 250ml
2.5M HCl 25ml ddH2O至250ml
13、2.5M HCl 100ml
濃HCl 21.55ml ddH2O至100ml
14、中和緩沖液 1L
1.5M NaCl 87.66g 1MTris?HCl 121.14gTris,HCl調pH7.4 加水至1L。

1. 用雙蒸水徹底淋洗膜。

2. 用20-30ml 0.2N NaOH，0.1%SDS(w/v)37℃震蕩洗滌2×20min。

3. 2×SSC平衡數分鐘。

4. 空氣干燥或立即用于雜交。